نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری رشته بیوتکنولوژی کشاورزی، گروه تولید و ژنتیک گیاهی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه محقق اردبیلی، اردبیل

2 استاد، گروه تولید و ژنتیک گیاهی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه محقق اردبیلی، اردبیل

3 دانشیار، گروه تولید و ژنتیک گیاهی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه محقق اردبیلی، اردبیل

چکیده

کیفیت و کمیت مناسب RNA برای انجام موفقیت‌آمیز مطالعات پروفایل بیان ژن مانند توالی ‏یابی RNA و ریزآرایه ‏ها مسئله ضروری است. جداسازی RNA از گیاهان دارویی مانند Borago officinalis که حاوی مقادیر بالایی از پلی‏ فنل ‏ها و پلی‏ ساکاریدها هستند، چالش بزرگی است. همچنین استخراج اسیدهای نوکلئیک از بافت‌های گیاهی که در معرض شرایط تنش‌زای ناشی از سمیت فلزات سنگین ازجمله کادمیوم قرار دارند به دلیل افزایش تجمع گونه‌های فعال اکسیژن و متابولیت‌های‌ثانویه دشوار است. در مطالعه حاضر پنج روش استخراج RNA شامل روش‏های مبتنی بر فنل-کلروفرم، CTAB، SDS، محلول استخراج RNX-Plus و RNX-Plus تغییریافته برای استخراج RNA از ریشه و برگ گاوزبان اروپایی در معرض تنش کادمیوم مقایسه شد. پس از بررسی روش‏های استخراج، یک دستورالعمل سریع، ساده و کارآمد مبتنی بر روش استخراج RNX-Plus تغییریافته ارائه شد که بر محدودیت‌های ناشی از کیفیت پایین و عملکرد کم RNA جداشده از این گیاه غلبه می‌کند. مقادیر نسبت‌های A260/A280 و A260/A230 برای RNA حاصل از روش RNX-Plus تغییریافته به ترتیب 2.1 و 2.07 بود که این نتایج خلوص بالای آن را نشان می‏دهد. عوامل مؤثری که منجر به حذف ناخالصی‏ ها در این روش تغییریافته شدند عبارت‌اند از: افزایش نسبت بافر استخراج به نمونه گیاهی پودر شده، استفاده از حجم بهینه کلروفرم، افزایش زمان ته ‏نشینی در دمای 20- درجه سانتی‌گراد، شستشو RNA با لیتیوم کلراید و شستشو مجدد با اتانول. همچنین غلظت 15± 333 و 43± 463 نانوگرم در میکرولیتر RNA با عدد یکپارچگی RNA  برابر با 8.6 و 9.05 به ترتیب از ریشه‏های تحت تنش کادمیوم و شاهد به دست آمد. ازآنجایی‌که RNA حاصل استانداردهای کنترل کیفیت را برای ساخت کتابخانه cDNA، RT-PCR و توالی‏ یابی RNA گذرانده است، می‏ توان آن را به‌عنوان روشی ساده و کارآمد برای استخراج RNA از این گیاه دارویی در نظر گرفت.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

Aboutalebi, S., Zare, N., Sheikhzadeh, P., 2023. Physio-Biochemical Response of Borago officinalis L. Roots to Cadmium Toxicity. Russian Journal of Plant Physiology. 70, 1-11. https://doi.org/10.1134/S1021443722601781
Asadi-Samani, M., Bahmani, M., Rafieian-Kopaei, M., 2014. The chemical composition, botanical characteristic and biological activities of Borago officinalis: a review. Asian Pacific journal of tropical medicine. 7, 22-28. https://doi.org/10.1016/S1995-7645(14)60199-1
Carpinetti, P.D.A., Fioresi, V.S., Ignez da Cruz, T., de Almeida, F.A.N., Canal, D., Ferreira, A., Ferreira, M.F.D.S., 2021. Efficient method for isolation of high-quality RNA from Psidium guajava L. tissues. PloS one. 16, 1-19. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0255245
Chomczynski, P., Wilfinger, W., Kennedy, A., Rymaszewski, M., Mackey, K., 2010. RNAzol® RT: a new single-step method for isolation of RNA. Nature Methods. 7, 4-5. https://doi.org/10.1038/nmeth.f.315
Deepa, K., Sheeja, T.E., Santhi, R., Sasikumar, B., Cyriac, A., Deepesh, P.V., Prasath, D., 2014. A simple and efficient protocol for isolation of high quality functional RNA from different tissues of turmeric (Curcuma longa L.). Physiology and Molecular Biology of Plants. 20, 263-271. https://doi.org/10.1007/ s12298-013-0218-y
Endrullat, C., Glökler, J., Franke, P., Frohme, M., 2016. Standardization and quality management in next-generation sequencing. Applied & translational genomics. 10, 2-9. https://doi.org/10.1016/j.atg.2016.06.001
Gaafar, A.R.Z., Al-Qurainy, F., Alshameri, A., Khan, S., Nadeem, M., Tarroum, M., Alansi, S., Shaikhaldein, H.O., Salih, A.M., Arrak Alenezi, N., 2021. High RNA quality extracted from the tolerant crop Cyamopsis tetragonoloba L. despite possession of low RNA integrity number. Biotechnology and Biotechnological Equipment. 35, 608-618. https://doi.org/10.1080/13102818.2021.1910567
Garg, R., Jain, M., 2013. RNA-Seq for transcriptome analysis in non-model plants. In: Ray, J.R. (eds.), Legume Genomics: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp. 43-58. https://doi.org/10.1007/978-1-62703-613-9_4
Healey, A., Furtado, A., Cooper, T., Henry, R.J., 2014. Protocol: a simple method for extracting next-generation sequencing quality genomic DNA from recalcitrant plant species. Plant methods. 10, 1-8. https://doi.org/10.1186/ 1746-4811-10-21
Hoagland, D.R., Arnon, D.I., 1950. The water-culture method for growing plants without soil. California agricultural experiment station. 347, 1-32. http://hdl.handle.net/2027/uc2.ark:/ 13960/t51g1sb8j
Johnson, M.T., Carpenter, E.J., Tian, Z., Bruskiewich, R., Burris, J.N., Carrigan, C.T., Chase, M.W., Clarke, N.D., Covshoff, S., Depamphilis, C.W., Edger, P.P., 2012. Evaluating methods for isolating total RNA and predicting the success of sequencing phylogenetically diverse plant transcriptomes. PloS one. 7, 1-12. https://doi.org/10.1371/ journal.pone.0050226
Kováčik, J., Klejdus, B., Štork, F., Hedbavny, J., 2011. Nitrate deficiency reduces cadmium and nickel accumulation in chamomile plants. Journal of agricultural and food chemistry. 59, 5139-5149. https://doi.org/10.1021/jf104793b
Laksana, C., Chanprame, S., 2015. A simple and rapid method for RNA extraction from young and mature leaves of oil palm (Elaeis guineensis Jacq.). ISSAAS. 21, 96-106.
Leng, Y., Li, Y., Wen, Y., Zhao, H., Wang, Q., Li, S.W., 2020. Transcriptome analysis provides molecular evidences for growth and adaptation of plant roots in cadimium-contaminated environments. Ecotoxicology and Environmental Safety. 204, 98-111. https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2020.111098
Liu, L., Han, R., Yu, N., Zhang, W., Xing, L., Xie, D., Peng, D., 2018. A method for extracting high-quality total RNA from plant rich in polysaccharides and polyphenols using Dendrobium huoshanense. PLoS One. 13, 1-9. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0196592
Masoomi-Aladizgeh, F., Aalami, A., Esfahani, M., Aghaei, M.J., Mozaffari, K., 2015. Identification of CBF14 and NAC2 genes in Aegilops tauschii associated with resistance to freezing stress. Applied biochemistry and biotechnology. 176, 1059-1070. https://doi.org/10.1007/s12010-015-1629-8
Moazzam Jazi, M., Rajaei, S., Seyedi, S.M., 2015. Isolation of high quality RNA from pistachio (Pistacia vera L.) and other woody plants high in secondary metabolites. Physiology and Molecular Biology of Plants. 21, 597-603. https://doi.org/10.1007/s12298-015-0319-x
Muoki, R.C., Paul, A., Kumari, A., Singh, K., Kumar, S., 2012. An improved protocol for the isolation of RNA from roots of tea (Camellia sinensis L.) O. Kuntze. Molecular biotechnology. 52, 82-88. https://doi.org/10.1007/s12033-011-9476-5
Nadiya, F., Anjali, N., Gangaprasad, A., Sabu, K.K., 2015. High-quality RNA extraction from small cardamom tissues rich in polysaccharides and polyphenols. Analytical biochemistry. 485, 25-27. https://doi.org/10.1016/j.ab.2015.05. 017
Opel, K.L., Chung, D., McCord, B.R., 2010. A study of PCR inhibition mechanisms using real time PCR. Journal of forensic sciences. 55, 25-33. https://doi.org/10.1111/j.1556-4029.2009.01245.x
Rodrigues, S.M., Soares, V.L., De Oliveira, T.M., Gesteira, A.S., Otoni, W.C., Costa, M.G., 2007. Isolation and purification of RNA from tissues rich in polyphenols, polysaccharides, and pigments of annatto (Bixa orellana L.). Molecular biotechnology. 37, 220-224. https://doi.org/10.1007/s12033-007-0070-9
Rodríguez-Serrano, M., Romero-Puertas, M.C., Sparkes, I., Hawes, C., Luis, A., Sandalio, L.M., 2009. Peroxisome dynamics in Arabidopsis plants under oxidative stress induced by cadmium. Free Radical Biology and Medicine. 47, 1632-1639. https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2009.09.012
Rubio-Piña, J.A., Zapata-Pérez, O., 2011. Isolation of total RNA from tissues rich in polyphenols and polysaccharides of mangrove plants. Electronic journal of Biotechnology. 14, 11-19. https://doi.org/10.2225/vol14-issue5-fulltext-8
Sheikhzadeh, P., Zare, N., Abootalebi, S., 2022. The effect of cadmium stress on photosynthetic pigments and secondary metabolites in borage (Borago officinalis L.). Environmental Stresses in Crop Sciences. 15, 1143-1160. [In Persian with English Summary] https://doi.org/10.22077/escs.2021.4245.1996
Sheng, Q., Vickers, K., Zhao, S., Wang, J., Samuels, D.C., Koues, O., Shyr, Y., Guo, Y., 2017. Multi-perspective quality control of Illumina RNA sequencing data analysis. Briefings in Functional Genomics. 16, 194-204. https://doi.org/10.1093/bfgp/elw035
Shivakrishna, P., Reddy, K.A., Rao, D.M., 2018. Effect of PEG-6000 imposed drought stress on RNA content, relative water content (RWC), and chlorophyll content in peanut leaves and roots. Saudi journal of Biological Sciences. 25, 285-289. https://doi.org/10.1016/j.sjbs.2017.04.008
Sinha, S., Saxena, R., 2006. Effect of iron on lipid peroxidation, and enzymatic and non-enzymatic antioxidants and bacoside-A content in medicinal plant Bacopa monnieri L. Chemosphere. 62, 1340-1350. https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2005.07.030
Sultan, M., Amstislavskiy, V., Risch, T., Schuette, M., Dökel, S., Ralser, M., Balzereit, D., Lehrach, H., Yaspo, M.L., 2014. Influence of RNA extraction methods and library selection schemes on RNA-seq data. BMC Genomics. 15, 1-13. https://doi.org/10.1186/1471-2164-15-675
Vidović, M., Ćuković, K., 2020. Isolation of high-quality RNA from recalcitrant leaves of variegated and resurrection plants. 3 Biotech. 10, 1-8. https://doi.org/10.1007/s13205-020-02279-1
Wang, C., Hou, X., Qi, N., Li, C., Luo, Y., Hu, D., Li, Y., Liao, W., 2022. An optimized method to obtain high-quality RNA from different tissues in Lilium davidii var. unicolor. Scientific Reports. 12, 1-11. https://doi.org/10.1038/s41598-022-06810-7
Wilhelm, B.T., Marguerat, S., Goodhead, I., Bähler, J., 2010. Defining transcribed regions using RNA-seq. Nature Protocols. 5, 255-266. https://doi.org/10.1038/nprot.2009.229
Wilson, I.G., 1997. Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification. Applied and Environmental Microbiology. 63, 3741-3751. https://doi.org/10.1128/aem.63.10.3741-3751.1997
Xu, C., Li, Z., Wang, J., 2022. Temporal and tissue-specific transcriptome analyses reveal mechanistic insights into the Solidago canadensis response to cadmium contamination. Chemosphere. 292, 1-11. https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2021.133501
Yang, X., Kang, Y., Liu, Y., Shi, M., Zhang, W., Fan, Y., Yao, Y., Li, H., Qin, S., 2021. Integrated analysis of miRNA-mRNA regulatory networks of potato (Solanum tuberosum L.) in response to cadmium stress. Ecotoxicology and Environmental Safety. 224, 1-11. https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2021.112682
Yockteng, R., Almeida, A.M., Yee, S., Andre, T., Hill, C., Specht, C.D., 2013. A method for extracting high‐quality RNA from diverse plants for next‐generation sequencing and gene expression analyses. Applications in Plant Pciences. 6, 1-6. https://doi.org/10.3732/apps.1300070
Yoshino, K., Nishijima, R., Kawakatsu, T., 2020. Low-cost RNA extraction method for highly scalable transcriptome studies. Breeding Science. 4, 1-6. https://doi.org/10.1270/jsbbs.19170
Yu, D., Tang, H., Zhang, Y., Du, Z., Yu, H., Chen, Q., 2012. Comparison and improvement of different methods of RNA isolation from strawberry (Fragria× ananassa). Journal of Agricultural Science. 4, 51-56. http://dx.doi.org/10.5539/jas.v4n7p51
Zhu, G., Xiao, H., Guo, Q., Zhang, Z., Zhao, J., Yang, D., 2018. Effects of cadmium stress on growth and amino acid metabolism in two Compositae plants. Ecotoxicology and Environmental Safety. 158, 300-308. https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2018.04.045